Después de escapar del ataque de los Templarios al final de Assassin's Creed II. Desmond Miles, Lucy Stillman, Rebecca Crane y Shaun Hastings huyen a Monteriggioni, estableciendo un nuevo escondite en las ruinas de la Villa Auditore. Después de restaurar la electricidad en los viejos túneles bajo la villa, el jugador una vez más toma el control de Ezio Auditore a través de la memoria genética de Desmond Miles usando el Animus 2.0. Su misión es encontrar el Fruto del Edén, un artefacto importante y misterioso que podría impedir el desastre inminente que está llegando en ese mismo año, que se cree fue perpetrado por los Templarios.
La historia de Ezio continúa en 1499, donde sale de la Bóveda, confundido por lo que vio en el interior. Escapa de Roma con su tío Mario Auditore y llega a Monteriggioni. Una vez en casa, Ezio es consolado por la posibilidad de que su venganza personal ha terminado y que sus días como un asesino han terminado; sin embargo, Nicolás Maquiavelo desafía la decisión de Ezio de dejar a El Español Rodrigo Borgia, ahora el Papa Alejandro VI, vivo. A la mañana siguiente, Monteriggioni es asediada por César Borgia, hijo de Rodrigo, quien asesina a Mario, secuestra a Caterina Sforza (una aliada que Ezio conoce en AC II) y se lleva el "Fruto del Edén". Ezio logra escapar con su familia por unos pasadizos secretos que hay en la villa y viaja a Roma, el centro de la Orden Templaria en Italia, una vez más, buscando venganza contra los Borgia. Allí, descubre que los Asesinos están fallando en la lucha contra la corrupción. Decidido a rescatar el Gremio, Ezio convence a Maquiavelo de que tiene todo lo necesario para reunir una Hermandad lo suficientemente poderosa como para destruir a los Templarios y su nuevo enemigo, César Borgia.
Durante los próximos cuatro años, Ezio ejecuta misiones con la intención de paralizar la influencia Borgia en la capital, saboteando los recursos de César y asesinando a personas clave cercanas y/o trabajando con él en el proceso, y poco a poco va restaurando Roma a su antigua gloria. Ezio se convierte en líder de la Orden y es ascendido al rango de Il Mentore (en italiano, "El Mentor").
César, sabiendo de las acciones de Ezio, se enfrenta a su padre y desesperadamente le pide más dinero y el propio Fruto, Rodrigo Borgia (el Papa) se niega e intenta envenenar a su hijo, al darse cuenta de que la ambición por el poder de César no puede ser mantenida a raya. César, sin embargo, da la vuelta a la mesa hacia su padre y lo mata. Ezio después de enterarse de la ubicación del Fruto, lo recupera tras una persecución y una batalla contra los guardias en el interior de la Basílica de San Pedro. Ezio la utiliza para aplastar las fuerzas de César y retirar el apoyo de sus seguidores. Cesár es arrestado por el ejército del Papa Julio II y es llevado a la prisión de Viana, España.
Ezio utiliza el Fruto, una vez más, para encontrar a César, que escapa de la cárcel y ha sitiado una pequeña ciudad en Navarra, Viana, España. Este se encuentra con César en las almenas de un castillo en ruinas y lucha contra él, César afirma que no puede ser matado por la mano del hombre, por lo que incita a Ezio a "dejar que el destino decida", dejándolo caer de las almenas. Tras esto, Ezio regresa a Roma y esconde el "Fruto" en una cripta construida debajo del Coliseo.